Статьи

Антителогенез у больных HCV-инфекцией

В.И. Лучшев, Т.Я. Чернобровкина, С.Н. Жаров

Кафедра инфекционных болезней, тропической медицины и эпидемиологии,  ГОУ ВПО «РГМУ МЗ РФ» (зав. кафедрой – проф. В.И. Лучшев)

 Введение

Из литературных источников известно, что геном вируса гепатита С (ВГС) кодирует три структурных белка: протеин С (core, ядерный), Е1 и Е2 (протеины оболочки) и четыре неструктурных белка: NS2, NS3, NS4 (A,B), NS5 (A,B). К каждому из белков в организме человека вырабатываются антитела, циркулирующие в крови. В настоящее время предлагается широкий спектр современных иммунологических и молекулярно-биологических диагностических тест-систем, а также гистологических исследований печени для выявления антительных, антигенных маркеров и RNA вируса гепатита С, различающихся своей чувствительностью и специфичностью [1, 2, 5, 8, 10]. Наиболее ранним маркером инфекции является обнаружение в сыворотке крови RNA-HCV через 1-3 недели от момента инфицирования. Однако, положительная RNA-HCV в сыворотке крови регистрируется только у 25% инфицированных ВГС на фоне нормальных уровней активности трансаминаз, поэтому чаще заболевание длительное время не диагностируется [2].

Обычно антитела к структурным белкам выявляются в сыворотке крови через 6-8 недель от инфицирования, причем они не обладают вируснейтрализующими свойствами, достаточными для элиминации вируса. Именно белки внешней оболочки (Е1 и Е2) ВГС имеют участки с высокой частотой аминокислотных замен, в результате которых образуются большое число генотипов и субтипов. Антитела к неструктурным белкам определяются в сыворотке крови несколько позже (через 10 недель от начала болезни) [3, 4, 5, 6]. В литературе появляется все больше данных о предполагаемых функциях и прогностическом значение как антигенов так и антител к ВГС. Считают, что нуклеокапсидный белок  активирует апоптоз инфицированных клеток, способствует увеличению числа рецепторов апоптоза на клеточной мембране гепатоцита и повышению чувствительности клетки к проапоптотическим стимулам. Так, за чувствительность к интерферону возможно отвечает NS5 (A,B) белок. Высокий титр  антител к поверхностным (структурным) белкам в острой фазе заболевания   характеризует благоприятное течение HCV-инфекции [3]. Отсутствие антител к NS5 белку у больных ОГС характерно для периода реконвалесценции [5].  Выявление анти-NS4 ассоциируется с поздними морфологическими стадиями болезни – циррозом печени [4, 7, 9]. Диагностическая интерпретация антител к NS3 неструктурному белку  по данным литературы неоднозначна. Кроме того, данные о маркерах вируса С изучались в образцах сыворотки крови больных в основном при моно инфекции HCV. Однако, доказанная репликация ВГС  не только в клетках печени, но и в клетках эпителия, кератиноцитах, лимфоидных клетках и даже клетках крови послужила основанием для исследования маркеров ВГС на эритроцитах крови больных [7, 11].

 Поэтому целью нашей работы являлось усовершенствование дифференциальной диагностики НСV-инфекции на основании исследования антител к структурным и неструктурным белкам ВГС не только в сыворотке, но и на эритроцитах крови больных.

Материалы и методы

 Изучение клинической картины, лабораторных показателей и антителогенеза проводилось у 57 больных, страдающих HCV-инфекцией и микст-инфекцией HCV + HBV. Первую группу пациентов получавших базисную терапию, составили 17 больных с острым гепатитом С (ОГС), вторую 15 с обострением хронического гепатита С (ХГС), третью 25 пациентов  с микст-инфекцией HCV+HBV по типу супер-инфекции острый гепатит В на фоне хронического гепатита С (ОГВ+ХГС). Пациенты находились на стационарном лечении в Инфекционной клинической больнице №3 г. Москвы (главный врач – Лазуткина Л.И.).


Верификацию вирусных гепатитов проводили с использованием иммуноферментного анализа (ИФА) и полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Определение спектра антител класса IgM и IgG к вирусу гепатита С в сыворотке и на эритроцитах крови проводилось методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест-систем «ИФА-АНТИ-HCV-СПЕКТР» и  «ИФА-АНТИ-HCV-СПЕКТР- GM» НПО «Диагностические системы» (г. Нижний Новгород). Исследование крови пациентов проводилось в день госпитализации, через 1 месяц. ИФА проводился строго по инструкции прилагаемой к каждой тест-системе с поэтапным добавлением в лунки планшета готовых реагентов. В основе метода лежит реакция рекомбинантных антигенов, сорбированных раздельно на стрипах полистиролового планшета с антителами в исследуемых сыворотках и на эритроцитах крови больных HCV-инфекцией. Венозную кровь брали из локтевой вены натощак и центрифугировали 5 минут с 1500 оборотов в минуту. Сыворотку крови отделяли, помещали в пластиковые контейнеры и хранили в морозильной камере. Верификацию вирусных гепатитов проводили с использованием иммуноферментного анализа (ИФА) и полимеразной цепной реакции (ПЦР). Оставшийся осадок так же помещали в морозильную камеру. Перед постановкой реакции, сыворотки крови пациентов размораживались, а осадок крови трижды центрифугировали с физиологическим раствором (0,9% NaCl) в течение 5 минут с частотой  1500 оборотов в минуту с целью приготовления отмытых разрушенных эритроцитов.

Учет результатов проводили спектрофотометрически при длине волны 450 нм. Рассчитывалась критическая оптическая плотность  (ОП) каждого антигена по формуле:

ОП крит. core-Ag = среднее значение ОП К- (core) + 0,2

Где 0,2 –  коэффициент, определяемый методом статистической обработки результатов на предприятии-изготовителе, а «К» - это жидкий отрицательный контрольный образец – сыворотки крови человека, не содержащая антитела к HCV, антитела к ВИЧ-1, 2, HbsAg и инактивированная прогреванием в течение 3-х часов при температуре 56 градусов по Цельсию.

Реакция считалась положительной при превышении результата над показателем критической ОП не менее чем на 20%.

ИФА проводился в лаборатории кафедры инфекционных болезней, тропической медицины и эпидемиологии РГМУ на базе клинической инфекционной больницы №3.

Результаты и обсуждение

При исследовании спектра маркеров HCV-инфекции в сыворотке и на эритроцитах крови, в условиях динамического наблюдения за больными получены следующие результаты.

У всех больных с моно-HCV-инфекцией при госпитализации в стационар обнаруживаются антитела к ядерному белку ВГС (100%) и в несколько меньшем проценте (84%) у пациентов с микст-инфекцией ОГВ+ХГС.  В динамике заболевания сохраняется 100% выявляемость этих антител во всех группах (табл. 1).

 Таким образом, наличие антител к core-белку в сыворотке крови практически у всех больных при поступлении в стационар и после базисной терапии может свидетельствовать о наличии у пациента только HCV-инфекции, не указывая на длительность течения и период заболевания. Следовательно, характерный спектр антител к структурному core-белку в сыворотке крови больных будет недостаточным для дифференциальной диагностики HCV-инфекции.

Параллельное определение спектра антител на эритроцитах крови показало, что в них сохраняется наибольшая выявляемость  антител к core-белку  у всех больных в период разгара и  в период реконвалесценции у пациентов с ХГС и микст-инфекцией, в противоположность ОГС (20%, р<0,02), что позволяет при одновременном сопоставлении  с сывороточным спектром антител к ядерному core белку  с большей вероятностью разграничить острое и хроническое течение  HCV-инфекции (табл. 2).

Отмечается 100% определяемость антител к NS3 белку ВГС в сыворотке у больных с ОГС и несколько меньшая частота у пациентов с ХГС (86,6%) при поступлении в стационар. Достоверно меньшая частота встречаемости антител к NS3 белку (68%) зарегистрирована у пациентов с микст-инфекцией ОГВ+ХГС по сравнению с ОГС (р<0,001). В динамике заболевания наблюдается достоверное увеличение частоты встречаемости антител к NS3 белку в сыворотке крови только в группе пациентов с микст-инфекцией ОГВ+ХГС (р<0,02). Таким образом, только по сывороточному спектру антител к NS3 белку у пациентов в сравниваемых группах нельзя предположить длительность течения заболевания, а можно только установить факт инфицирования вирусом гепатита С.

Однако при исследовании этих антител на эритроцитах крови достоверно низкий процент встречаемости анти- NS3 наблюдается у пациентов с ОГС и микст-инфекцией ОГВ+ХГС по сравнению с ХГС в период реконвалесценции (р<0,05). Следовательно, низкий процент встречаемости антител к NS3 белку у больных на эритроцитах крови в противоположность высокому сывороточному уровню позволяет предположить острое течение заболевания.  В случае же сочетанного вирусного поражения печени, по-видимому, имеет место взаимоингибирование ВГВ над ВГС.

Таким образом, выявленные изменения антителогенеза к ядерному и неструктурному NS3 белкам при совместном определении в сыворотке и на эритроцитах крови позволяют с большей достоверностью сориентировать практического врача в дифференциальной диагностике и возможно в прогнозе заболевания.

Достоверных различий при сравнении антител к NS4 белку в сыворотке крови в сравниваемых группах в период разгара не выявлено. В период ранней реконвалесценции отмечается тенденция к снижению частоты встречаемости антител к NS4 белку у больных с ОГС, без достоверных отличий. Увеличение процента встречаемости антител к NS4 белку отмечается у пациентов с ХГС и микст-инфекцией ОГВ+ХГС, причем при микст-инфекции это увеличение является достоверным по сравнению с показателем при поступлением (р<0,05).

При сравнении частоты встречаемости антител к NS4 белку в сыворотке крови через 1 месяц у больных ОГС отмечается достоверно меньший процент, по сравнению с другими группами, что с большей вероятностью позволяет предположить благоприятное течение HCV-инфекции (р<0,02). С другой стороны, на эритроцитах тех же больных (ОГС) в период разгара и реконвалесценции эти антитела не выявляются. Таким образом, соотношение уровня этих антител в сыворотке и на эритроцитах может дать определенную информацию о стадии заболевания.

 Практически похожая картина уровней антител отмечается при изучении динамики антител к NS5 белку. Отсутствие этих антител на эритроцитах выявлено у пациентов ОГС независимо от периода заболевания. Следовательно, их отсутствие в сыворотке и на эритроцитах может служить возможным указателем на острый характер заболевания.

Выводы

1. Полученные результаты свидетельствуют о том, что  сыворотка крови и эритроциты больных HCV-инфекцией различаются по спектру антител и этот спектр зависит не только от длительности течения заболевания, но и от периода заболевания.

2. Полученные данные показывают необходимость одновременного определения антител как к структурным, так и неструктурным белкам ВГС как в сыворотке так и на эритроцитах крови пациентов.

3. Высокая чувствительность иммуноферментного метода, позволяющая определять наличие антител на эритроцитах крови, наряду с технической простотой выполнения, высокой скоростью исследования и низкой стоимостью позволяют  использовать этот метод в стационарных и амбулаторных условиях.

 

ЛИТЕРАТУРА

1. Бурков А.Н., Блинова Т.В., Маянский А.Н., Лапшина Г.М. Вирусные гепатиты и их диагностика в иммуноферментных системах. Метод. Рекомендации. Нижний Новгород 1998.-47с.

2. Воронкова Н.В. Хронический гепатит С с нормальным уровнем трансаминаз: клиника, диагностика, тактика ведения больных. Автореф. дис. к.м.н.-М.,-2002.-28с.

3. Ветров Т.А. Клиническое значение определения антител к поверхностным белкам вируса гепатита С. Автореф. дис. к.м.н.-С-П.,-2003.-14с.

4. Гончарук М.Ю., Мазепа В.Н., и др. Тез. докл. Научной конф.//Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней.-С-П.,1999.-с 52-53

5. Дудина К.Р. Автореф. дис. к.м.н.-М.-2003.-23с.

6. Демиденко Т.П., Каменцева А.Н., Кузнецов Н.И. и др. Хронические вирусные гепатиты (этиология, патогенез, подходы к терапии): Учебно-метод. пособие для врачей -Л.,2003.-35с.

7. Жаров С.Н. Особенности клинико-патогенетического течения и лечения парентеральных вирусных гепатитов. Автореф. дис. д.м. н.-М.-2003.-45с.

8. Жмуровская Л.С., Ключарева А.А., Казак В.Е. К диагностике вирусных гепатитов смешанной этиологии.// Мед. новости.-2000.-№5.-с.64-65

9. Лучшев В.И., Жаров С.Н., и др. Динамика антител к структурным и неструктурным белкам у наркоманов с HCV-инфекцией.//Эпидемиология и инф. болезни.-2001.- №6.-с.30-32

10. Мукомолов С.Л. Вирусный гепатит С. Клинико-эпидемиологическая и лабораторная характеристика. Автореф. дис. д.м.н.- С-П.-1994.-35с.

11. Lotz G.,Szalay F.,Firneisz G et al.,Localization on hepatitis C virus RNA on human erythrocytes by in sity PCR technique//Scand J Gastroenterol.-E.,2002 May 37(5)

 

Резюме:

Проведено комплексное клинико-лабораторное обследование пациентов с HCV-инфекцией и микст-инфекцией HCV+HBV, включающее определение параметров специфического гуморального ответа. Установлен дифференцированный характер спектра антител к структурным и неструктурным белкам вируса гепатита С (ВГС) в сыворотке и на эритроцитах крови пациентов в зависимости от периода заболевания (разгар и ранняя реконвалесценция) и характера течения (острый и хронический гепатит). Результаты позволяют предложить параллельное исследование спектра антител к белкам ВГС в сыворотке и на эритроцитах крови пациентов в целях усовершенствования дифференциальной диагностики  HCV-инфекции, обьективизации ее прогноза и определения лечебной тактики.

 

Ключевые слова: вирусный гепатит С (ВГС), антитела и антигены ВГС, антителогенез ВГС в сыворотке и на эритроцитах крови, структурные и неструктурные белки ВГС 

Вернуться

Наши врачи

Фахрединов Геннадий Анатольевич
Газизова Луиза Ришатовна
Орлов Владимир Владимирович
Резниченко Андрей Александрович
Ведение беременности Задать вопрос Оставить отзыв

Новости клиники

Все
20.09.2018

Новый адрес клиники

Подробнее
05.08.2018

Клиника не работает с 6 августа по 19 августа.

Подробнее
10.01.2017

Изменения в стоимости услуг

Подробнее
10.12.2016

Контракты по ведению беременности

Подробнее